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有没有做牛结核分子流行病学方面的

liang_au 发表于: 2008-10-28 13:24 来源: 百慕社区

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hefl1004 at 2008-10-28 19:03:42

牛结核病的现状及诊断研究进展＊

王云霞1，2，于三科1*，翟军军1

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵 712100；2.陕西勉县畜牧兽医技术推广中心，陕西勉县724200）

  

摘 要：牛结核病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病，是一种人兽共患传染病，其传播流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。由于卡介苗(BCG)的使用，结核病的发病率比过去有所下降。但近年来由于艾滋病等其它原因，该病发病率又呈上升趋势。至今牛结核病所造成的损失大于牛的其他各种疾病所造成损失的总和。要从根本上控制牛结核病的发生与流行，必须加强对本病的研究，以便为控制和消灭牛结核病提供技术支持。文章对牛结核病的现状及诊断方法做了综述。

关键词：牛；结核病；现状；诊断

牛结核病在畜间主要易感染高产奶牛和使役牛。笔者在实际检测工作中总结发现大部分结核杆菌感染牛多为高产奶牛和青壮年使役牛，引起奶牛产奶量下降，役牛消瘦无力，最后因心力衰竭而死。在人类，调查发现多发于15岁~20岁青壮年，尤以环境艰苦且从事繁重体力和脑力劳动的人多发此病。感染者消瘦低抗力下降，健康状况恶化，呼吸极度困难后因肺咯血而死。牛结核病给人类健康和畜牧业发展带来严重影响，也成为世界性的公共卫生问题。随着我国人民生活水平的不断提高，人们对健康生活的要求也迅速提高，与之相一致的是乳制品需求量的迅速攀升，随之带动了奶牛业在近几年的迅猛发展。因此对结核病疫情的密切关注已迫在眉睫。控制本病的传播和蔓延，主要措施为彻底治疗感染病人，及时检疫并根除病牛。要做到这些必需加强对本病的研究，建立一种适用于我国的牛结核病临床检测方法，以达到控制和消灭结核病的目的。

1 牛结核病的现状

牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分支杆菌(M.tuberculosis)所引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病，可通过病畜传染给人和其他动物。

在那些还流行牛结核病的国家中，人类始终受到该病的威胁，除非消灭了牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的[1]。近年来由于人口的增长、流动人口的增加、艾滋病毒感染的传播，以及因用药不当导致耐药菌株的产生和国家结核病控制规划不完善，公众对结核病的忽视等，致使结核病疫情加重，有的国家和地区呈持续上升趋势。据世界卫生组织(WHO)报告，目前全球每年新发结核病800万~1 000万人，因结核病死亡约300万人，新发成年结核病人中艾滋病感染者占12%，新发病例中耐药病人占3.2%。一个未经治疗的传染性肺结核病人1年能传染10个~15个健康人。20世纪80年代后期到90年代初期，由于结核病疫情在全球回升，世界卫生组织于1993年宣布：“结核病处于全球紧急状态”。结核病已成为当前世界上成年人传染病中的主要杀手，已对国际公共卫生构成严重挑战。我国的疫情也不容乐观，全国活动性肺结核病人约500多万人，每年因结核病死亡约15万人，目前是全球22个高负担国家之一，其严重性仅次于印度，居世界第二位[2]。

据世界卫生组织统计资料，1986年—1990年25%的发达国家和41.5%的发展中国家结核病疫情在上升[3]，牛结核病在美国、英国、日本等发达国家经过实施“检疫—扑杀”等措施，疫情一度被控制，但近年来由于自然界中野生动物储存宿主，艾滋病感染及耐药菌株的出现，牛结核病又有所抬头。在发展中国家的不发达地区疫情更呈现蔓延的趋势。

作为传染源，牛型结核与人型结核相互感染。人类结核病变在临床上X线和病理学检查均很难区别是结核分支杆菌或牛分支杆菌所致，时间、地点、情况不同，人结核中牛分支杆菌引起的频率各异。牛分支杆菌可感染给人，人结核分支杆菌也可感染给牛和其他动物。研究表明，人结核病和牛结核病有着密切的关系，研究发现牛结核病患病率高，是因邻近有结核病人。调查显示结核病人家中饲养的牛结核病患病率高于健康人家庭饲养牛的2倍。

牛结核病不仅是一个公共卫生问题，也是一个社会经济问题，对人类的公共健康构成很大威胁，因此对结核病的研究各国政府及此类疫病专家应该高度重视。

2 病原学研究

结核病的致病菌是分支杆菌属中的结核菌属中的结核菌。分支杆菌属于放线菌目分支杆菌属，包括结核分支杆菌、牛分支杆菌和禽分支杆菌。该菌为专性需氧菌，是一种细长而稍弯曲杆菌，长约1.5  μm~ 4  μm，宽0.2 μm~ 0.5 μm，无鞭毛，无运动性，不形成芽胞，无荚膜，不产生内外毒素，革兰氏染色阳性。因经品红染色后即使酸性酒精也无法脱色，故又称抗酸杆菌。

由于分支杆菌富含类脂和蜡脂，因此对外界环境抵抗力强。阴湿处可生存5个月以上，阳光曝晒2 h，700 mL/L~750 mL/L酒清接触2 min，60 ℃温度持续10 min~30 min，85 ℃持续5 min或90℃持续1 min均可杀死。对消毒剂50 mL/L石碳酸、40 g/L氢氧化钠和30 mL/L福尔马林敏感[4]。

牛结核病与人结核病可相互传播。人结核分支杆菌可感染牛，牛分支杆菌也可感染人、绵羊、山羊、猪和犬等其他动物。

3 流行病学研究

历史上结核病在全世界范围内广泛流行，一度成为重大公共卫生问题。到目前为止，结核病除了感染人外，还能感染50多种哺乳动物和20多种禽类。牛是最敏感的动物，奶牛尤为敏感。

人的结核主要以呼吸道传播为主。患者在咳嗽、打喷嚏时，将病菌排出体外。这些带菌的微小痰沫在空气中悬浮，很容易被周围的人及动物吸入肺部，在机体抵抗力差的情况下，入侵的结核分支杆菌不被机体防御系统消灭而不断繁殖，造成咳嗽、胸痛、气短、咯血等症状，而引起结核病。中、青年人由于精神和工作压力，加上不注意休息和营养而多发。

牛分支杆菌主要通过呼吸道、消化道方式传染。患结核病的牛咳嗽时，可将带菌飞沫排于空气中，人和牛及其它动物吸入即可感染。散养牛患结核病率为1%~5%，而圈养奶牛因畜舍通风差，互相接触密切，若不加强管理其传播速度将非常迅速。

食用带菌的乳汁或乳制品是人感染牛支杆菌的主要途径。因为患病奶牛的乳汁中带有大量牛分支杆菌，从健康牛挤出的乳汁也可能通过牛舍中的飞沫和尘埃而被结核分支菌所污染。如果饮用未经消毒或消毒不彻底的污染乳汁也会感染结核病。随着牛奶在人正常饮食中比重的加大，人的结核病发病率也在上升，社会流行病学研究显示，二者呈明显的流行病学相关性[5]。

另外，病畜、病禽的排泄物也可带菌，养殖场如果对其管理不善，这些排泄物可能再度污染水源、流入田地，从而感染人和其它动物。

本病无季节流行性，一年四季均可发生，在农村主要以散发为主，规模化养殖厂以区域性流行为主。检疫不严格，盲目引种，对检出阳性牛不能及时处理，未能从根本上消灭传染源，以及人畜间相互感染等是造成牛结核病不断发生和流行的主要原因。

同时，随着中国改革开放后，人口流动急剧增加，这也在一定程度上加速了结核病的流行；近年来，抗菌素的大量应用，导致了许多耐药结核菌株的出现和传播，给结核病的治疗带来了很大困难；由于人结核病可以与艾滋病合并感染，中国大陆目前艾滋病流行呈上升趋势，更使得结核病的流行日趋严重[6]。我国结核病流行主要有5个特征即高感染率、高死亡率、高耐药率、人畜共患和多途径传播。

4 诊断方法研究

目前，国内外用于诊断牛结核病的检测方法，大体上可分为三大类：第一类是细菌学检查法，如涂片镜检、细菌培养等。第二类是分子生物学方法，如核酸探针、PCR和DNA图谱方法。虽然这些方法具有敏感强，特异高等特点，但只适用于实验室研究，还不能够用于基层的推广。第三类是免疫学方法，如皮内变态反应、ELISA等方法。这些方法已广泛应用于结核病的临床诊断。

4.1 细菌学方法

结核病的细菌学检查，是发现传染源的主要手段和途径。涂片染色法所需材料、设备简单，操作方法简便，是较为普遍应用于发现和防治结核病传染源的重要诊断依据。但是，由于此法检出的细菌只能说明有抗酸杆菌，而不能准确地鉴定出结核分支杆菌和非典型分支杆菌。因此，缺乏特异性。细菌培养法由于结核生长缓慢，一般需要4周~8周时间，且有10% ~20%的病例结核菌培养失败[7-8]。由于种种条件的影响，阳性率较难提高。引进先进设备进行结核菌快速培育，由于费用昂贵，也不易推广和普遍应用，而且检出率低，敏感性差，在临床实验室开展尚不实际。

4.2 分子生物学诊断技术

随着分子生物学技术的飞速发展，研究者也将分子生物学的原理引入了结核病实验研究范围。聚合酶链反应(PCR)是一种以化学为基础的分子生物学诊断技术，是生物医学和兽医学领域内最有价值的研究手段之一。经过数年的努力积累了大量的资料和经验，使这一方法不断完善，其反应灵敏、特异、快速的特性在多数报告中得到肯定[9]。PCR技术操作并不复杂，但要求有很高的技术质量。因扩增子气溶胶污染而导致的假阳性和因标本中抑制物质存在而导致的假阴性以及试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果可信性的关键。为此研究人员正在不断开发出新的高度敏度和高特异性的PCR方法，如逆转录PCR法、套式PCR法、单管套式逆转录PCR法、实时荧光PCR、酶联PCR[10]等，在一定程度上提高了PCR方法的敏感性和特异性。研究者还将分子生物学原理应用于结核菌的耐药性测定及核酸指纹分析耐药基因的检测和分子流行病学方面，取得了重大进展。

近年来，国内外学者采用分子遗传学方法研究几种主要抗结核药物作用的分子机制及其耐药性的分子基础，建立了快速检测结核杆菌耐药基因型分子生物学技术。今后应更广泛研究主要抗结核药物靶基因突变与耐药性的关系，寻找简便，实用的分子生物学技术，将不同来源的结核杆菌进行基因分型，对于阐明结核杆菌的遗传变异规律及分子进化等方面有着重要的流行病学意义。

4.3 免疫学诊断技术

(1)提纯结核菌素皮内变态反应。变态反应诊断是目前有实际意义的诊断方法。迄今为止，尚无一种临床和实验室的诊断方法能比提纯结核菌素(PPD)皮内试验更有效地检出结核病牛。但不足之处在于对因感染其他分支杆菌而致敏的动物没有特异性，不能判断病情，且在那些因病情严重而导致免疫反应低下的动物易出现假阴性。而当感染副结核分支杆菌等环境分支杆菌时，则可能呈现假阳性反应[11]。另外PPD的质量和剂量，结果判定标准及操作方法等因素均能影响检测结果，故需进行质量控制。因此，寻求特异敏感的诊断抗原以及制定一套严格统一的规范化操作标准，已成为牛结核病诊断技术研究的重要方面。

（2）血清学诊断技术。这项技术起始于19世纪末，主要是检测血清内的结核菌抗体。它是一种快速、简便的检查技术，并且在多种疾病的诊断中得到广泛应用。目前，报道研究最多的血清学诊断技术主要有γ-干扰素(gamma-interferon-γ，IFN-γ)诊断法、ELISA法等。IFN-γ诊断法的原理是将试验牛血样淋巴细胞培养，加入特异性PPD一起孵育16 h~24 h，由于致敏的淋巴细胞能够释放出γ-干扰素，因此可用IFN-γ-ELISA进行定量测定。牛IFN-γ测定法已在许多国家完成了田间试验，证明该方法的敏感性为77%~93.6%，高于结核菌素试验结果解释的主观性，缩短了试验的时间。而且据Ryan J J等[12]报道，在皮内试验进行后的2 d～8 d内再进行IFN-γ试验，其灵敏度和特异性未有显著影响(分别为85%和93%)，因此可以作为皮内试验理想的补充试验。

酶联免疫吸附试验(ELISA)法，目前在许多国家已得到应用。采用牛分支杆菌PPD、老结核菌素聚合OT、牛分支杆菌原生质抗原以及氯化钾浸出抗原进行的ELISA试验结果表明，以PPD-ELISA效果较好，所以不少国家均建立了PPD-ELISA检测牛结核病的方法。经过对比试验证明，PPD-ELISA的敏感性和特异性分别为70%~90%和70%~95%。在结核杆菌血清学试验中，ELISA作为传统结核杆菌试验的补充试验对于鉴别阴性和假阴性反应具有重要作用。Amadori M等[13]报道，将M. tuterculosis的编码ESAT-6(M.bovis基因组也编码该蛋白成分)、MTSA-10(有文献称之为CFP10)、PT51、MPT63的基因，以及M. bovis的编码MPB59、MPB64、MPB70的基因，经适当的表达体系表达以获得相应的重组蛋白抗原。纯化后作为包被抗原用于ELISA检测方法，通过采用多种重组抗原组合，可以大大提高ELISA方法的灵敏度和特异性。在西方一些国家，ELISA诊断方法在结核病流行病学调查中的应用大大缩减了对牛结核病控制与消灭计划的开支[14]。但这一方法存在的主要问题是结核杆菌的抗原性较弱，且属间和种间共同抗原决定簇的存在及体液免疫与结核病的相关性未得到充分的阐明，致使ELISA这一血清学诊断技术难以取得实质性的进展。

另外，还有胶体金诊断法和免疫过氧化物酶试验，前者目前在医学界已有试剂盒出售。但在兽医界，尚未见报道。张喜悦已开展了这方面的工作，初见苗头，但成本偏高[15]。后者是通过单克隆抗体以检测牛分支杆菌MPB70抗原的一种简便鉴定方法。从1957年开始已被澳大利亚多数兽医实验室所采用，与传统检验方法相比，其优点是检测速度快、成本低、操作简便。本试验最早在载玻片上进行，后改用硝酸纤维膜载体，在检测分支杆菌混合感染时尤其出色[16]。

5 小结

综上所述，由于分子生物学检测需要特殊的仪器设备，技术相对复杂，对实验室条件和操作人员的要求比较高，现阶段还较难在生产实践中普遍推广；免疫学检测虽然简单易行，但由于目前试剂昂贵，导致大规模实施的成本过高，落实推广有待时日。迄今为止，经典的PPD皮内试验依然是一致得到大家公认的标准检测方法，但其不足也是显而易见的，因而临床上迫切需要新的诊断标准。目前，提法最多的趋向于用结核杆菌检测的常规方法与分子生物学技术有机结合，将为结核病的临床诊断与防治提供科学的依据。




参考文献（略）

hefl1004 at 2008-10-28 19:05:12

http://scholar.ilib.cn/A-zgrsghbzz200604022.html

这是一篇收费的文章。

[ 本帖最后由 hefl1004 于 2008-10-28 19:06 编辑 ]

liang_au at 2008-10-31 16:23:26

呵呵，非常感谢你，版主！

liang_au at 2008-10-31 16:31:56

转载了，